劲马生物大鼠血红素氧合酶1（HO-1）试剂盒使用手册

【产品名称】

中文名称：大鼠血红素氧合酶1（HO-1）酶联免疫试剂盒

【包装规格】

96T/盒

【预期用途】

仅供科研使用，本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中血红素氧合酶1（HO-1）含量。

【检测原理】

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠血红素氧合酶1（HO-1）水平。用纯化的大鼠血红素氧合酶1（HO-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血红素氧合酶1（HO-1），再与HRP标记的血红素氧合酶1（HO-1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血红素氧合酶1（HO-1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠血红素氧合酶1（HO-1）浓度。

【产品性能】

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气(如有漏气，不影响使用）。

2、剂量反应曲线线性

标准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。

3、检测范围

70pg/ml-1700pg/ml 。

4、灵敏度

检出剂量不能小于17.5pg/ml。

5、精密度

精密度用样品测定值的变异系数CV 表示。CV（%） = SD/mean×100

批内差：取同批次试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测，每份样本连续测定20 次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD 值。

批间差：选取3 个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本进行定量测定，每个样本使用同一试剂盒重复测定10 次，分别计算不同浓度样本的平均值及SD 值。

批内差： CV<4.9%

批间差： CV<6.5%

6、回收率

分别往5个不同样本中添加已知浓度的目标蛋白，做回收实验，得出回收率范围和平均回收率。

【操作步骤】

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

1600pg/ml5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

800pg/ml4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

400pg/ml3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

200pg/ml2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

100pg/ml1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

7.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

8.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10-20分钟。

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意：

1.试剂准备：试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用。准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。

2.加样：实验操作中请使用一次性的灭菌吸头，避免污染。加样时注意不要有气泡产生，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。与反应试剂加入一样，加样过程中第一个孔与最后一个孔加样时间间隔尽量小（一般控制在10 分钟以内），如果太大，将会导致不同的“预温育"时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。为了测值的准确性，推荐设置复孔进行实验。

3.温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4.洗涤：浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。充分洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔内残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将吸水纸直接放入反应孔中吸水，同时要轻轻擦除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。如果使用自动洗板机，请在熟练使用后再用于正式实验过程中。

5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如观察到颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强而影响酶标仪光密度读数。

6.底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。