细胞蛋白质总量样品的制备

简介

蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。

与细胞总蛋白的提取实验相似的是动物组织的总蛋白提取，它需要匀浆机或者研磨棒将组织块分散，再加入裂解液并提取蛋白质。

原理

细胞蛋白的提取是生物学实验中一种常见的实验方法，是很多其他生物学实验的前提。通过加入裂解缓冲溶液以及相应的蛋白酶抑制剂，能较好的保持细胞内生物大分子的天然状态，在透膜剂以及超声破碎仪的辅助下，细胞将发生破裂，内容物释放出来。

用途

1. 蛋白免疫印迹；

2. 蛋白免疫沉淀；

3. 核浆分离等制备型和分析型实验。

材料与仪器

细胞、细胞刮、裂解液、枪头、烧杯、超声破碎仪，离心机，EP 管，制冰机，记号笔。

步骤

一、蛋白提取

1. 从培养箱中取出待提取的细胞，用吸引器洗掉培养基后，将培养皿置于冰上；

2. 往培养皿中加入适量的裂解液，并加入相应量的蛋白酶抑制剂，一般来说，12 孔板加入100 μL 裂解液，6 cm 皿加入 300-400 μL 裂解液，晃动培养皿，使得裂解液流过细胞表面；

3. 在冰上用细胞刮将细胞刮离培养皿，并收集到 1.5 mL EP 管中；

4. 在冰上超声破碎细胞（根据仪器的功率调节），一般超声 10-15 下即可；

5. 超声好的细胞放入离心机中，12000 g，4℃，离心 15 分钟；

6. 离心完后，取出 EP，小心的将上清液转移至一干净的 EP 管中，待用。

二、蛋白浓度的测定

1. 取 96 孔板，5 孔，每孔加入 10 μL 0.9% NaCl，最后一孔加入 10 μL 2 mg/ml 的 BSA 溶液，在倒数第二孔加入 10 μL BSA，用移液枪吹打混匀之后，吸出 10 μL 至倒数第三孔中，同样操作一直至第二孔混匀后，弃 10 μL 溶液，此为标准曲线孔；

2. 另取孔，每孔 8 μL 0.9% NaCl 溶液，再加入 2 μL 提好的蛋白溶液；

3. 按照蛋白浓度测定试剂盒的说明配制好测定液，在上述浓度测定孔中每孔加入 200 μL 混合液，将平板放入 37℃ 生化箱中孵育 15-20 分钟，再用酶标仪测定，做出标准曲线并计算每个蛋白样品的浓度；

4. 提取好的蛋白上清液加入等量的 2 x loading buffer，并在沸水中煮沸 15 分钟；

5. 一般细胞样品按照 30 μg 的总上样量计算出相应的上样体积，记录备用，并用于后续实验。

注意事项

1. 有些蛋白容易降解，所以样品需要一直放在冰上，样品用完后短期负二十冰箱保存；

2. 勤换枪头，避免交叉污染；

3. 超声的次数和功率不能剧烈，容易使得蛋白断裂；

4. 检测磷酸化蛋白，尽量添加磷酸酶抑制剂；

5. 由于某些蛋白的特性，样品不需要煮沸。

常见问题

1. 蛋白拖尾？

可能是超声太过剧烈，并且超声太过剧烈，对于一些小体积的样本，非常容易造成样品飞溅，损失样品。

2. 蛋白浓度太低？上样量太大？

应按照个人经验和不同细胞的特性，适当的调整裂解液加入的体积，并且在最后可以加入 5 x loading buffer 来变性样品。