实战经验丨竞争性ELISA：受体蛋白包被浓度及配体蛋白-Tag饱和浓度的确定

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01 

·Tag饱和浓度的确定：

1. 包被：用1×包被液将受体蛋白稀释若干个浓度（如2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL），每孔加入100µL包被液，4℃包被过夜（确定最佳包被浓度）；

2. 洗涤：弃去（或回收）板内液体，用PBST洗涤液（0.05%吐温20）每孔200µL，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干；

3. 封闭：加入封闭液（1%BSA溶液），每孔200 µL，保鲜膜包裹酶标板，放置于37℃水浴锅中，水浴1h；

4. 配制配体蛋白-Tag溶液：用样品稀释液将配体蛋白-Tag稀释至1 µg/mL（稀释液为0.5% BSA），3倍系列稀释，共10个梯度（封闭结束前半小时，防止样品变质）；

5. 加样：每孔加入100 µL配制好的配体蛋白-Tag溶液，保鲜膜包裹后，放置于37℃水浴锅中水浴2h；

6. 洗涤：弃去板内液体，用PBST洗涤液每孔200µL，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干。

7. 加酶标二抗：每孔加入100 µL二抗溶液（稀释液为0.5% BSA），37℃水浴锅中水浴1.5 h；

8. 洗涤：弃去板内液体，用PBST洗涤液每孔200µL，每次洗涤3min，洗涤5次，拍干；

9. 显色：每孔加入100µl显色液（TMB），显色15 min；

10. 终止：每孔加入50 µL 10%硫酸终止；

11. 检测：酶标仪检测OD450和OD630的吸光度值。

注：最终依据拟合的浓度-吸光度曲线，确定合适的受体蛋白包被浓度，并且同时确定该包被浓度下的配体蛋白饱和浓度。

02 

1. 用先前确定的最佳的受体蛋白包被浓度包被板子，同上述条件洗涤，封闭；

2. 配置不同起始浓度的待测抗体：用样品稀释液将待测抗体稀释若干个浓度（如80 µg/mL、40 µg/mL、20 µg/mL、10 µg/mL），再将上述稀释液进行3倍稀释，共10个梯度（封闭结束前半小时，防止样品变质）；

3. 在受体蛋白包被板中加入2倍饱和浓度的配体蛋白-Tag溶液，每孔50 µL，立即加入50 µL系列稀释的待测抗体，保鲜膜包裹后，放置于37℃水浴锅中水浴2h；

4. 洗涤：弃去板内液体，用PBST洗涤液每孔200µL，每次洗涤3min，洗涤3次，拍干。

5. 加酶标二抗：每孔加入100 µL二抗溶液（稀释液为0.5% BSA），37℃水浴锅中水浴1.5 h；

6. 洗涤：弃去板内液体，用PBST洗涤液每孔200µL，每次洗涤3min，洗涤5次，拍干；

7. 显色：每孔加入100µL显色液（TMB），显色15 min；

8. 终止：每孔加入50 µL 10%硫酸终止；

9. 检测：酶标仪检测OD450和OD630的吸光度值。

总结

ELISA实验是实验室十分常规的检测手段，总体操作难度不大，但由于操作步骤繁多，且结果较为灵敏，容易出现结果差异较大的现象，因此需要格外注意上样的顺序及加样量，以保证尽可能缩小误差。竞争性ELISA较普通ELISA实验额外多出一个实验组分，需要在开展正式实验之前尽可能多摸索几个各个组分的工作浓度，以保证最终的结果在较好的范围内呈现。