考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

 中文名称：考马斯亮蓝

英文名称：Coomassie brilliant blue

定义：属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；考马斯亮蓝G250是布拉德福德（Bradford）蛋白质定量试剂的主要成分。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

该方法用于大多数蛋白质的定量是比较的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于细胞骨架的检验。

1．Bradford浓染液的配制：

将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200mL，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

2．标准曲线蛋白质样本的准备：

尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之间绘制标准曲线。

3．溶解：

将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（用PBS）。

4．稀释：

按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。

5．作用：

每个样本加5mL

稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．

6．计算：

根据标准曲线计算待测样本的浓度。

考马斯亮蓝处理方法

考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。