植物细胞死活鉴定实验指南

一、实验目的

掌握植物细胞活性快速检测方法

评估外界胁迫（如重金属、干旱）对细胞存活率的影响

为原生质体制备、转基因筛选等实验提供质量监控

二、实验原理

死亡细胞膜完整性丧失，台盼蓝（Trypan Blue）染料可透过破损的细胞膜与细胞内蛋白质结合显蓝色；活细胞因膜结构完整而拒染保持无色。

三、实验材料与器具

（1）材料准备

新鲜植物叶片（拟南芥/烟草）

0.4%台盼蓝溶液（用PBS缓冲液配制）

酶解液（含2%纤维素酶+0.3%离析酶+0.6M甘露-醇）

（2）仪器设备

光学显微镜（100-400倍）

血球计数板

恒温水浴摇床（25℃）

离心机（1000rpm）

四、实验步骤

样本制备阶段

叶片消毒：70%乙醇浸泡30s→无菌水冲洗3次

酶解处理：将1cm2叶片置于5mL酶解液，25℃黑暗振荡3h

终止反应：加入等体积0.6M甘露-醇，轻柔吹打10次

染色检测阶段

染色混合：细胞悬液与台盼蓝按9:1比例混匀

计时观察：静置3min后立即镜检（超过5min需重做）

计数规则：

血球计数板四角大方格计数

细胞轮廓完整且呈蓝色判定为死细胞

每个样本重复计数3次

数据处理

存活率(%) = (总细胞数-蓝色细胞数)/总细胞数×100

五、注意事项

关键控制点：

酶解时间冬季需延长0.5h

染色时避免强光直射

常见问题：

细胞聚集→增加甘露-醇浓度至0.8M

背景染色→用预冷PBS冲洗2次