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13817140470更新时间:2013-07-05 浏览次数:2145
荧光素标记抗体的方法——Marsshall 氏法
材料:
抗体球蛋白溶液、0.5mol/L、pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25~50ml)、冰及冰槽(或1000ml烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯(500ml)、pH7.2或8.0的0.01
mol/L PBS等。
方法及步骤:
①抗体的准备:取适量已知球蛋白浓度之溶液,置入三角烧瓶中,加入生理盐水及碳酸盐缓冲液,使zui后蛋白浓度为20mg/ml,缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将三角烧瓶置冰槽中,电磁搅拌(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。
②荧光素的准备:根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克蛋白加0.01mg
荧光素,用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
③结合(或称标记):边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上(大约5~10min内加完),加毕后,继续搅拌12~18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右,故须及时添冰去水;亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。
④透析:结合完毕后,将球蛋白的溶液离心(2500r/min)20min,除去其中少量之沉淀物,装入透析袋中后再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透
析(0~4℃)过夜。
⑤过柱:取透析过夜的标记物,过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。
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