凋亡与凋亡检测试剂盒

        细胞凋亡过程中可观察到系列形态学特征和生化特征。早期凋亡信号的效应产生于胞内，此时细胞膜保持完整。现已发展出几种方法以检测凋亡细胞胞内的多种效应，包括：DNA 片段的检测、膜对称性的变化、caspases 激活、以及细胞死亡相关蛋白水平的变化等。多数检测使用的底物和Marker 适用于绝大多数种类的哺乳动物。
　　凋亡细胞染色体DNA 以核小体为单位的切割导致细胞不可逆死亡。可以采用Nucleosome ELISA，对产生的单体及寡聚核DNA 片段进行定量。核小体的DNA 成分被捕获于酶标板上，使用生物素标记的抗组蛋白抗体检测捕获的核小体数量。组蛋白-DNA 片段的量反应了一个特定样品中死亡及濒临死亡的细胞的量。
　　DNA 片段也可通过片段末端标记进行原位检测，DNA 片段末端标记可通过荧光染料或比色底物方法进行检测。另外，细胞形态的变化如胞膜皱摺或出泡、核染色质致密、胞质浓缩等，都可作为细胞凋亡的证据。采用荧光染料进行末端标记的可用流式细胞技术进行定量，其光散射变化也可支持由单一参数得出的结论。DNA 片段可以从凋亡细胞中分离（Suicide TrackTM DNA ladder Isolation Kit, ）并使用琼脂糖电泳进行分析。约180bp 的多倍寡核小体片段在电泳上呈典型的梯状条带，可进一步证实凋亡的存在。若使用Pellet Paint Co-Precipitant，只需室温操作，两分钟即帮助DNA 沉淀更快捷方便。
　　线粒体膜电位和膜通透性的变化也是凋亡细胞一个重要特点。可使用Cytochrome c ELISA Kit或Cytochrome c Release Apoptosis Assay Kit试剂盒检测凋亡细胞线粒体所释放的细胞色素C。也可使
用Cytosol/Mitochondria Fractionation Kit分离凋亡细胞线粒体，其膜电位可通过MitoCaptureTM Apoptosis Detection Kit检测。凋亡细胞另一个生化特征是细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸从胞质转至胞外。膜联蛋白中的Annexin Ⅴ，是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有强亲和力。通过使用Annexin Ⅴ-FITC或 Annexin Ⅴ-Biotin ,Apoptosis Detection Kit ，及RAPIDTM 方法进行凋亡细胞早期检测。可使用流式细胞仪或荧光显微镜监测。同时使用PI，根据细胞膜的通透性区分早期凋亡细胞和坏死细胞。
　　凋亡过程中细胞核同样发生了结构变化。接收到凋亡信号后，核基质蛋白（NMPs）释放。NMP 的释放与细胞死亡相，MERCK 的Cell Death Detection（NMP） ELISA可定量检测细胞培养上清中的NMP 水平变化。此种检测方法优于其它方法的原因在于可以直接检测组织培养基中NMPs 的水平，而不需细胞总裂解物，从而避免了细胞计数和样品准备等操作。除了结构变化，凋亡细胞谷胱甘肽水平会降低，可通过Glutathione Apoptosis Assay Kit进行检测。
　　凋亡可被系列环境危害、发育信号等诱导产生，免疫耐受的诱导和保持，涉及细胞表面受体的参与。Fas（APO-1, CD95） 是主要的死亡受体，在多种细胞中引发凋亡过程。Fas 配体（FasL/CD95L）与Fas 结合，激活的Fas 进而激活包含caspase 在内的几种效应蛋白。FAS/APO-1 ELISA Kit可以检测细胞抽提物、组织培养物、血清中Fas 的水平。同样，Fas Ligand ELISA 可定量检测上述各种形式样品中的膜结合FasL 和可溶性FasL。两种检测试剂盒都具有很好的灵敏度和度。另外两种ELISA 试剂盒都提供96 孔板形式，适于高通量筛选。
　　Caspases 参与Fas 介导的细胞凋亡的情况现已阐明。Caspase-8 和caspase-9 启动效应因子caspase-3 ，后者切割细胞内含有特定识别序列的底物。针对caspases 的活性检测，通过对特定底物的切割、释放出荧光产物。同时提供阳性对照、阴性对照、特异的caspase 抑制剂以辅助解释实验结果。另外caspase-3 、caspase-8  和caspase-9 活性检测试剂盒都提供高通量形式帮助筛选鉴定触发细胞凋亡信号的因子。
　　现已发现几种抑制凋亡的蛋白。Bcl-2 家族是此领域现在了解zui多的一系列蛋白。Bcl-2 的切割和失活可用Bcl-2 ELISA监测。已发现凋亡过程中Bcl-2 水平降低，DNA 降解片段、Annexin Ⅴ的结合、NMP 水平增加等。为*了解细胞凋亡，一个具体实验可能需要联合应用以上述及的几种检测手段以确定凋亡进程。