IHC一般出现的问题

从技术上说，IHC和ICC实验并不难，然而，每个实验又有那么多的变量需要鉴定和优化。若运气不佳，实验结果不太好，那么我们可能要做个troubleshooting，看看问题到底出在哪儿。下表就列出了IHC/ICC实验的常见问题，以及相应的对策。
问题1：缺乏染色
可能原因对策

缺乏抗原通过原位杂交检查蛋白表达。
因储存不当，抗体不起作用按照说明书上的说明储存。一般来说，将抗体分装成小份，足够单次实验使用。将这些抗体储存在手动除霜的冰箱中（-20 to -70 °C），避免反复冻融。
一抗或二抗失活独立检测报告系统，以评估试剂是否有用。
组织固定不足尝试增加固定时间或换一种固定剂。

组织过度固定减少浸润或固定后步骤的持续时间。如果浸润固定无法避免，那么通过抗原修复试剂，让抗原不被遮蔽。
一抗与二抗不兼容使用能与一抗相互作用的二抗。例如，如果一抗来自兔子，那么就使用抗兔的二抗。

在固定或包埋过程中表位已改变通过各种抗原修复技术尝试恢复免疫反应性。在58°C或以下包埋组织。
抗原修复不起作用增加处理时间或改变处理溶液。

试剂遗漏或顺序不对重复染色过程，确认使用了正确的试剂，并以正确顺序添加。
问题2：高背景
可能原因对策

一抗或二抗的浓度高滴定抗体，以确定促进一抗和二抗的特异反应所需的*浓度。。
组织中抗体和蛋白的疏水相互作用降低抗体稀释液的离子强度（特别是单克隆抗体）。

一抗或二抗与组织的非特异结合在一抗孵育之前采用封闭步骤（通常使用1% BSA和10% 正常驴血清）。脱脂奶粉也是个选择。
二抗的非特异结合使用交叉反应性IgG被去除的抗体。

组织变干在染色过程中避免让组织变干。
离子相互作用引起的背景提高稀释液的离子强度。

问题3：细胞/组织形态被破坏

可能原因对策
抗原修复方法太过剧烈根据经验确定实验条件，既能保留组织形态，又能恢复抗原的免疫反应性

组织切片从玻片上脱落增加固定时间。根据经验确定另一种固定剂。
组织切片撕裂或折叠。切片下有气泡重新切片，或在分析结果时忽略受损区域。

组织形态的分辨率差切出更薄的组织切片。冰晶可能会破坏冰冻切片的形态。
固定不足在染色过程中会导致组织或细胞受损延长固定时间。提高固定剂/组织的比例。切出更小的组织，以便更*的浸润。

组织自溶导致坏死碎片的染色延长固定时间、比例。考虑使用交联的固定剂。
问题4：染色不当
可能原因对策

固定方法不当尝试另一种固定剂，或延长固定时间。
抗原修复可能不当尝试另一种抗原修复条件。
抗原的静电荷被改变尝试调整抗体稀释液的pH或阳离子浓度。
固定拖延导致抗原扩散快速固定组织。尝试交联固定剂，而不是有机固定剂。