上海劲马Trizol总RNA提取试剂说明

Trizol总RNA提取试剂
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一、 试剂盒说明
上海劲马-TRIzol 是一种快捷方便的总 RNA 提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总 RNA。在样品处
理过程中，TRIzol 可*充分裂解样品，同时保持 RNA 的完整性。加入氯-仿离心后，溶液形成上清层（水相）、中间层
和有机相（下层）。取出上清层，可用异丙醇沉淀回收 RNA；中间层用乙醇沉淀回收 DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收
蛋白。
 上海劲马TRIzol 试剂可用于少量样品的 RNA 提取，也可用于大量样品的 RNA 提取。提取 RNA 整个过程方便快速，整
个操作过程可一个小时内完成，提取的 RNA 无蛋白和 DNA 的污染，纯度髙，可直接用于 Northern Blotting、斑点杂交、
polyA 筛选、mRNA 纯化、体外翻译、RNase 保护分析、RT-PCR、构建 cDNA 文库等各种分子生物学实验。
二、 试剂盒组份

TRIzol 试剂 20 mL 50 mL 100 mL
三、 操作步骤
RNA 提取过程的关键是建立一个无 RNase 的实验环境，因此在整个操作过程中要防止 RNase 的污染，应注意
以下几点：
1. 实验过程中经常更换新手套，使用超净台，在操作过程中避免讲话；
2. 应尽量使用无 RNase 的实验器材；枪头、塑料制品和玻璃制品可以用 0.1％DEPC水溶液在 37℃
处理过夜，然后在 120℃下高压灭菌 30min 以去除残留的 DEPC。玻璃制品也可用干热灭菌去除 RNase（180℃
烘烤 2h）；
3. 配制溶液应使用无 RNase 水（无 RNase 水的配制方法：双蒸水加入 DEPC 至终浓度 0.01％ V/V，放置过夜，然
后 120℃下高压灭菌 30min，备用）；
4. 整个实验过程中使用的试剂，实验器材和无 RNase 水应，避免交叉污染。
用户自备试剂：氯-仿、异丙醇、75％乙醇（用 DEPC 处理过的水配制）、无 RNase 的无菌水。
1． 样品处理
A 贴壁培养细胞
1 倒净培养液；
2 每 10cm2生长的培养细胞中加入 1mL 凯基 TRIzol 试剂，在室温下水平放置 5min，使裂解液均匀分布于细胞表
面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落；
3 将细胞裂解液转移至离心管中，并用 1mL 枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置 5min，使得
核酸蛋白复合物*分离；
B 悬浮培养细胞
1 直接离心收集细胞，倒净培养液；
2 细胞沉淀中每 5～10×10
6细胞加入 1mL 凯基 TRIzol 试剂；
3 将细胞裂解液转移至离心管中，并用 1ml 枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放 置 5min，使
得核酸蛋白复合物*分离；C 动、植物组织材料
1 将组织在液氮中磨碎成粉末状（应无明显颗粒）；
2 每 50～100mg 的组织加 1mL 上海劲马 TRIzol 试剂，样品的体积不应超过 TRIzol 试剂体积的 10％，并用匀浆器进
行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；
3 将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置 5min，使得核酸蛋白复合物*分离；
4 12,000g， 4℃离心 10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中；
2． 向上述步骤 1 得到的裂解液中加入氯-仿（每使用 1mL 上海劲马 TRIzol 加 0.2mL 氯-仿），盖紧离心管管盖，用手上下振荡
15s（请勿涡漩激烈振荡），得桔红色浑浊液，无分层现象，室温静置 3min；
3． 12,000g，4℃离心 15min；
4． 取出离心管，样品分为三层：黄色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取黄色上清水相移至
另一离心管，水相的体积约为所用上海劲马 TRIzol 试剂的 60％；
5． 向步骤 4 得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置 10min；
6． 12,000g，4℃离心 10min；
7． 小心去除上清，缓慢沿管壁加入 1mL75％的乙醇（用 DEPC 处理过的水配制），轻轻混匀。每使用 1mL 上海劲马 TRIzol
试剂至少加 1mL 75％的乙醇；
8． 12,000g，4℃离心 10min；
9． 小心吸尽上清；
10．室温干燥沉淀 2～5min（不可晾得太干，否则 RNA 将会很难溶解），加入 30～50μL 的无 RNase 水溶解 RNA 沉淀，
待*溶解后于-70℃保存。取 RNA 样品用 1×TE Buffer（见备注）稀释样品 100 倍或适当的倍数，测定样品在 260nm
和 280 nm 的吸收值确定 RNA 的质量。
RNA 的浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μL，OD260/280 在 1.8～2.1 视为抽提的 RNA 的纯度很高。
四、 注意事项
本试剂含强变性剂，应避免与皮肤接触，如接触皮肤，应立即用大量的水冲洗，根据需要情况到医院处理。本
品含有酚类、巯基-乙醇等成分，具有特殊气味，请于吸取试剂溶液后马上盖好瓶盖，或于通风橱中操作。
五、 常见问题分析以及解决方案
1. 一般情况下每毫克的组织或 1×10
6个细胞中所能提取的 RNA 量见下表：
组织材料 TotalRNA 提取量
上皮细胞 约 10μg
成纤维细胞 约 6μg
肝脏 约 5μg
肾脏 约 3μg
肌肉或脑 约 1.5μg
2. 常见问题以及解决方案
常见问题 可能原因 建议解决方案
产率低
含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在
室温静置，或静置的时间不足 5 分钟
严格按照说明书操作
RNA 不*溶解 缩短晾干时间
三相分离时，吸取上清液不* 尽量回收上清液
A260/A280＜1.65
测定 OD 值时用的是水溶液 更换测定 OD 值时的溶液，用 TE
Buffer
TRIzol 加量太少，造成蛋白质变性不
充分
严格按照说明书操作含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在
室温静置，或静置的时间不足 5 分钟
严格按照说明书操作
RNA 不*溶解 缩短晾干时间
三相分离后，吸取上清液时不小心接
触蛋白层造成污染
小心吸取上清
RNA 降解
使用的组织材料不够新鲜 提取 RNA 的组织材料应采用新鲜
的组织材料，或将新鲜的组织材料
用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存
细胞用胰酶消化 不要用胰酶消化细胞
提取 RNA 时使用的试剂及器材中有
RNase 污染
做好试验前的准备工作，保证无
RNase 污染
提取的组织材料中含有大量的 RNase 加大 TRIzol 的用量
DNA 污染
裂解组织或细胞使用的 TRIzol 量偏少 加大 TRIzol 的用量
使用的组织材料中含有大量的有机溶
剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的
Buffer、碱性溶剂等
用 DEPC 水充分洗涤组织
多糖的污染
多糖的理化学性质与 RNA 十分接近，
因此很难将其从 RNA 中除去
加大 TRIzol 的用量