活性测试使用步骤详细解答

Caspase活性测试是如何使用的？这个问题困扰了很多老师。根据我司欧阳技术的细心探讨，终于得出结论。活性测试该如何使用呢？

Caspase活性测试为在细胞裂解液中检测蛋白酶活性提供了简捷方便的手段。当对专一Caspase的多肽底物被裂解时，释放出的指示分子可用普通读光仪或荧光读板仪来做定量测定。将从细胞凋亡样本得到的信号同未经诱导的对照样本进行比较，可以确定Caspase活性增加的倍数，而Caspase酶活性是同检测到的信号直接成正比。

Caspase是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含10多个成员。其中Caspase-1是*可剪切IL-1?和IL-18前体产生活性细胞因子的caspase。Caspase-11剪切45kD的caspase-1前体蛋白产生20kD和10kD片断，这两个片断可以形成异源二聚体，并进一步形成四聚体。此四聚体具有蛋白酶活性。Caspase-1通过剪切Bcl-XL调节细胞凋亡，并通过对细胞因子前体的剪切来调控相关细胞因子介导的免疫炎性反应。  
测定原理基于Caspase-1特异水解多肽底物Tyr-Val-Ala-Asp-p-nitroanilide (YVAD-pNA)，释放的游离硝基苯胺pNA在405 nm有zui大吸光度。采用可见光光度比色法测定pNA而得到Caspase活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞Caspase-1活性。 

上海劲马生物根据样品测定操作：  

1. 按下表设置96孔板反应体系。底物zui后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。

2. 盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。

3. 样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量，并以蛋白浓度校正之。

 4. 测得的Caspase酶活性表示方法有两种。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 实验处理组OD / 实验对照组OD，简单而可靠。(2)样品Caspase酶活力单位/mg protein，但计算较复杂，参见说明。 
反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)    无样品 空白对照  高酶活性 样品  低酶活性 样品  反应缓冲液μl 95 85 60 待测样品μl － 10 35 底物 μl 5 5 5 总体积μl  100  100  100