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BIM知识课堂：Western化学发光检测常见问题
更新时间：2016-10-25 浏览次数：2035
底物化学发光ECL是Western blotzui常用的显色方法之一，其原理是辣根过氧化物酶在H2O2的作用下，氧化化学发光物鲁米诺（Lumino）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
Fig：ECL发光检测原理示意图
ECL法具有操作简单，灵敏度高，线性范围广等特点，现将该方法使用中zui常出现的问题以及解决方法汇总如下：
| 现象 | 原因 | 解决办法 |
| 信号弱或无 | HRP过高引起底物迅速耗竭 | 稀释一抗/二抗 |
| 抗体-抗原系统敏感性过低 | 提高抗体浓度/蛋白上样量 | |
| 转膜不充分/过转 | 优化转膜条件 | |
| HRP或底物活性降低 | 测试活性或选用敏感底物 | |
| 高背景 | HRP过高(背景较高) | 稀释一抗/二抗 |
| 封闭时间不足 | 延长封闭时间4度过夜 | |
| 抗体与封闭液有交叉 | 更换封闭液(如3% BSA的TBST) | |
| TBST洗脱不足 | 增加洗脱时间、次数、用量 | |
| 曝光时间过长 | 降低曝光时间 | |
| 抗原-抗体浓度过高 | 降低抗体浓度或蛋白上样量 | |
| 条带内无显影的白点 | 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) | 精细操作 |
| 膜平衡不均/油脂污染 | 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜 | |
| 膜与X光片间有气泡 | 显影前去除气泡 | |
| 非特异性条带 | 抗体交叉反应 | 稀释一抗/二抗 |
| 散在小圆斑 | 封闭液有杂质颗粒 | 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层 |
| 反影(白色条带,黑色背景) | HRP过高(背景较高) | 稀释一抗/二抗 |
| 显影后膜上条带处变为黄色 | HRP过高(敏感性太高) | 稀释一抗/二抗 |
上海劲马生物科技有限公司试剂盒产品特点：
⇒ 高灵敏度的非放射性检测系统：可检测低至100fg～1pg的抗原，适用于痕量抗原的检测。
⇒ 高分辨率：本底极低，即使长时间曝光，背景仍然极低，远远优于国产与进口同类产品。
⇒ 半衰期长：信号衰减慢，12个小时以上仍可感光X光胶片。
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