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免疫组化遇到的问题及其解决办法(表)


发布日期:[2017-07-13] 共阅[580]次

1、染色过强:

原因

解决办法

抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度(一般指浓缩性抗体)抗体孵育时间:室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高,孵育温度超过37℃一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高显色时间不能超过5-10分钟,以显微镜下观察为准

2、非特异性背景染色:

原因

解决办法

操作过程中冲洗不充分每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭,孵育时间延长
组织中含内源性生物素正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间

3、染色弱:

原因

解决办法

抗体浓度过低,孵育时间过短提高抗体浓度,孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期及时更换试剂
操作中,滴加试剂时缓冲液未沥干,致使试剂稀释每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(但防止切片干燥)
室温太低,低于15℃若室温低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟(或4℃冰箱过夜)
蛋白封闭过度封闭时间不要超过10分钟

4、染色阴性:

原因

解决办法

操作步骤错误重新试验,设立阳性对照
组织中无抗原设立阳性对照片,以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗与二抗种属无误

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