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详谈ELISA夹心法中抗体质量的重要性(请猛戳)


发布日期:[2017-11-09] 共阅[467]次

   理论上使用公认选择的亲和纯化抗体可得到高特异性,高敏感度的免疫测定。然而,由于经济原因或是缺乏合适的试剂,使得许多工作者采用低纯度的制品,这种试剂通常含有与试验中其它成分起交叉反应的抗体。现已发现在用抗人IgG抗血清的抗体时,抗体中含有不需要的抗体交叉反应。但当使用亲和纯的抗血清时,交叉反应不明显。研究任何ELISA系统,为了控制不需要的交叉反应,就要不惜使用亲和纯试剂。使用抗IgG血清抗体作为包被抗体,有时本底确实很低,但它的敏感度比仅使用亲和纯制品要低50-100倍。在高敏感度的实验中应用封闭试剂是很重要的。zui终选择非亲和纯抗IgG血清抗体是基于这样设想:包被抗体或是结合的人IgG(抗原)与指示抗体有交叉反应,则过量的与指示抗体同种动物的血清,就可以封闭与酶标抗体的不要的结合。然而人血清白蛋白中含有少量的IgA和IgG会干扰检测。人血清白蛋白只适用于IgE的测定。同样,不能用牛血清白蛋白。因为其中含有微量的牛IgG。


抗血清抗体与亲和纯抗体对ELISA夹心法结果的影响可从下面实验看出:
实验A:包被抗体为粗制的绵羊抗人IgG抗体,指示抗体(检抗)为粗制山羊抗人IgG抗体
实验B:包被抗体为亲和纯的绵羊抗人IgG抗体,指示抗体(检抗)为粗制山羊抗人IgG抗体
实验C:包被抗体为粗制的绵羊抗人IgG抗体,指示抗体为亲和纯的山羊抗人IgG抗体
实验D:包被抗体和指示抗体都是亲和纯的兔抗人IgG抗体。
实验中使用5%血清(与指示抗体同物种来源)进行封闭,其他夹心法ELISA步骤相同。

                   
   结果显示,当粗制的抗IgG血清抗体被用在夹心法的两端(如实验a曲线)时,本底很高且曲线坡度不明显。虽然能成功应用此抗体类型,但问题是一种抗体结合另一种抗体。可能发生了山羊指示抗体结合了绵羊包被抗体,因为稀释液中的山羊血清过剩也不能降低本底值。当应用亲和纯化的包被抗体时(如实验b曲线),本底适当降低而且形成了标准曲线。然而,大多数工作者认为本底仍偏高,工作范围有限(2-60ng/ml)。当亲和纯的指示抗体与粗制包被抗体联合使用时(如实验c曲线),本底大大较低,但敏感度约为100-200ng/ml,再者工作范围仍受限。当完全使用亲和纯的抗体时(如实验d曲线),本底低,敏感度大大改善且工作范围广(2-500ng/ml)。


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