上海劲马手把手教您做免疫共沉淀实验

   免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。
一.工作液配制：
配制100ml的modified RIPA buffe：
1、称取790mg的Tris-Base，加到75ml去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用 HCl调节PH值到7.4；
2、加10ml 10%的NP-40；
3、加2.5ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
4、加1ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2～8℃ 保存；
5、理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
二.各种成分在工作液中的终浓度：
Tris-HCl：50mM，pH7.4
NP-40：1%
去氧胆酸钠：0.25%
NaCl：150mM
EDTA：1mM
PMSF：1mM
抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1μg/ml
Na3VO4：1mM
NaF：1mM
三.实验步骤：
1、转染后24～48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，细胞裂解液于4℃，zui大转速离心30min 后取上清；
2、取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；
3、取10μl protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm，离心3min；
4、将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃ 缓慢摇晃孵育 2～4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；
5、免疫沉淀反应后，在4℃以3000rpm 速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3～4次；zui后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；
6、SDS-PAGE，Western blotting或质谱仪分析。
四.通过免疫共沉淀确定结合蛋白：
1、用磷酸盐缓冲液洗30块10cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC 裂解缓冲液中。
2、将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃ 以zui大速度离心15min。
3、收集上清（约30ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h。
4、加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min。
5、用含900mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。zui后，用NETN洗一次。
6、吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。
7、将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。
8、通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9、从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50% 乙腈洗两次，每次3min。
10、用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11、通过窄孔液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
五.注意事项：
1、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％ SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
2、使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
3、使用对照抗体：
① 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
② 兔多克隆抗体：正常兔IgG
4、在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：
① 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生
② 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀
③ 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。