劲马小课堂:如何测定蛋白质的稳定性?

   细胞中的蛋白质通过合成和降解等活动控制处于恒定状态。为了使细胞更，减少不必要的蛋白质负荷，细胞中的大多数蛋白质都有一个明确定义的半衰期。细胞进化到降解蛋白质的另一个原因是，确保及时清除已经完成工作的蛋白质(如细胞周期蛋白)，避免由于某些蛋白质的构成作用而可能发生的不良影响(如放松管制在细胞周期蛋白的蛋白酶体降解会加速不受控制的癌细胞的扩散)。今天上海劲马将介绍一些常用的测量蛋白质稳定性的方法。
一、脉冲追踪：
   这是一种追踪蛋白质并估计其稳定性的传统方法，除了涉及到处理放射性，这种方法在测量蛋白质半衰期时比其他药理方法具有明显的优势，在实验室中仍然经常使用。它不仅能测量蛋白质半衰期，而且如果你擅长放射自显影和亚细胞分离，还可以追踪蛋白质并确定其亚细胞定位。
   实验涉及在短时间内用放射性前体标记细胞(脉冲，通常是在培养基中添加放射性的甲硫氨酸和/或半胱氨酸)，然后在蛋白质动力学过程中，在培养基中添加未标记的前体，细胞被允许恢复。随着带有标记前体的旧蛋白在细胞内被降解，使用未标记前体的新蛋白同时被合成。在不同的时间点免疫沉淀蛋白质，用放射自显影法测量样品中的放射性。根据非放射性蛋白质取代放射性蛋白质的速度，可以确定任何蛋白质的半衰期。这种方法的另一种非放射性变异是zui近流行的bleach-chase(漂白追踪)，具体方法是目的蛋白与荧光团融合，进而通过短暂的光脉冲来漂白，漂白促使标记蛋白分为了两种亚群：荧光蛋白和非荧光蛋白，漂白后荧光恢复率与降解速率相关。
二、环己酰亚胺追踪：
   这是一种更简单的方法来替代脉冲追踪和避免放射性的使用。通常，这种方法通过添加环己酰亚胺来抑制蛋白质的合成，然后评估目的蛋白随时间的降解情况。环己酰亚胺是一种新的蛋白质合成抑制剂，通过与60S核糖体单位的E -位点结合，抑制翻译的延伸。而这反过来又会抑制蛋白质的合成，使研究人员不必担心正在进行的蛋白质合成的影响，就能跟踪蛋白质的降解情况。加入环己酰亚胺将蛋白质合成排除在外，使研究人员能够专门研究蛋白质降解随时间的变化。

                  
三、降解途径的药理学抑制剂：
   细胞内有两种主要降解途径：蛋白酶体途径和溶酶体途径。有一些特定的药理学抑制剂可用于评估这两种途径的降解。蛋白酶体途径通过一系列酶将蛋白质用泛素标记，这种泛素标记的蛋白质zui终定向到细胞蛋白酶体复合物，并在此被降解。但在某些情况下，蛋白酶体降解可能独立于泛素化而发生，在对可能的降解途径的假设进行测试时，这一点不能忽视。更复杂的是，泛素化可能也会在溶酶体降解途径中发挥作用。溶酶体降解也被分为许多不同的类型，基于实际的降解细胞机制的细微差别(大自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬)。
   为了评估目的蛋白是否通过蛋白酶体途径降解，可以通过药物抑制蛋白酶体复合物，并评估这种干预对目的蛋白表达的影响。研究人员通常使用蛋白酶体抑制剂如MG-132，Epoxomicin和硼替佐米，这些抑制剂与蛋白酶体复合物中特定的蛋白水解位点结合并阻止蛋白质的降解。还有一种药理学抑制剂和遗传策略研究自噬降解，这是一个值得单独讨论的话题。用于研究这种降解方式的抑制剂如氯喹和BafimlmycinA1，通过中和溶酶体中的酸性pH值来发挥作用，而这是溶酶体蛋白酶作用的必需条件。然后建立相关的剂量和持续时间，同时检查细胞的生存能力，以确保使用这些药物治疗细胞，但不会杀死细胞。
四、降解相关的翻译后修饰：
   确定了目的蛋白的降解路径，就可以分析哪些标签(翻译后修饰，PTM)是这个过程必须的。有许多类型的PTMs可以标记蛋白质降解，也有特定的降解基序(降解决定子)，靶向蛋白质降解途径。一些常见的降解决定子如D-boxes，PEST, and KEN boxes，可以帮助蛋白质标记，并通过各种机制促进蛋白质的降解。一些降解决定子能使蛋白更易接近E3连接酶，E3连接酶可以将其带到蛋白酶体复合物中。
   在开始对蛋白质进行突变分析之前，检查蛋白质的一级氨基酸序列，以确定是否有任何特定的降解决定子。如果文献中没有降解相关PTMs的优先级，有一些特定的数据库可以快速检查，如PhosphoSite (磷酸化和其他PTMs)和mUbiSiDa(泛素化)。
   在缩小你认为与降解相关的残留物后，下一步是改变这些残留物，并评估这些突变对目的蛋白稳定性的影响。例如，在降解相关的位点上，一个赖氨酸突变为精氨酸，可以去除泛素连接所必需的epsilon氨基，并能稳定蛋白质。类似地，如果认为磷酸化对降解是关键的，那么磷酸缺陷的(如丝氨酸到丙氨酸)和磷酸模拟突变(如丝氨酸到谷氨酸)可以改变目的蛋白的降解曲线。
五、分析蛋白质的泛素化动力学：
   蛋白酶体降解往往先于泛素化。检测泛素化可以提供一个强有力的数据，证实目的蛋白很有可能成为蛋白酶体的靶点。比如拉下目的蛋白，然后使用抗泛素蛋白抗体来评估其泛素化状态。当IP样本被抗泛素抗体检测时，你通常希望看到的是一个涂片或梯形条带效应。这是因为不同的更高修饰形式的蛋白质被识别，因为它们逐步被多个泛素分子标记。在蛋白酶体阻滞后，检测到的泛素涂片的强度可能会变深——表明多泛素化蛋白的积聚。泛素化蛋白是出了名的不稳定，并且收集细胞的具体实验条件和时间必须经过仔细的优化，以防止在样本准备过程中泛素化的丢失。因为在许多情况下，基于抗体的方法可能由于非特定的下拉。一种更好更清洁的方法是将目的蛋白标记his标签，并利用镍柱亲和拉下，评估蛋白质的泛素化。另一个好的控制方法是使用HA标记的泛素质粒，并在下拉之前将其与目的蛋白共转染。去除这些质粒中的一种或两种，应该减少或甚至消除泛素化。