看劲马教你:如何从实验室小白逆袭成为高手

        当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。如何从一个实验小白逆袭成为一个实验高手呢？掌握这些，看您离高手还有多少距离！

一、怎样选择适合你实验需要的抗体？

1. 一抗选择要点
       （1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。
       （2）确定你的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，还是FACS。一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明 书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。
       （3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。
        （4）样本蛋白的结构性质。了解样本蛋白的结构性质有助于选择合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。
        （5）单多克隆抗体的选择。市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。

2. 二抗选择要点
      （1）种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
       （2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应，而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。

二、抗体的稳定性
       （1）抗体的稳定性是自然界长期进化的结果。抗体是免疫系统中重要的分子之一，其稳定性是自然进化筛选的结果。在众多物种中，抗体分子形成了保守而稳定的结构。
       （2）抗体分子的高Tm值。在室温下，甚至短时间温度达到50-60℃，抗体分子都能维持正确折叠，保持应有的活性。
       （3）抗体的纯度。采用先进的抗体纯化技术，确保抗体产品的高纯度，保障其抗体产品的稳定性。
       （4）抗体的浓度。高浓度的抗体产品可减少容器表面吸附造成的物质损失，高浓度的抗体稳定性更好，抗体产品中93%的浓度大于0.5mg/ml。

三、怎样确定抗体购买渠道和品牌？
    国外抗体品牌的质量一般没问题，但价格较贵，而且很多抗体品牌本身不生产抗体，所以能找到OEM抗体生产商生产的*抗体，随着网络技术的越来越普及，我们自己就可以通过国内外的相关来检索.

四、怎样保存已获得的抗体？
    抗体无论是保存还是运输都应尽可能地避免反复冻融，收到抗体后请根据实验的需要，对抗体进行分装，避免同一管抗体反复冻融（反复冻融会导致抗体空间结构变 性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力）。抗体保存得当与否，直接决定了抗体的活性和使用效果，如果抗体保存得当，抗体活性大部分都可以维持数年。 请谨记，无论何时请按照说明书推荐的保存条件正确处理和保存抗体。

       （1）收到抗体后，请务必在4℃，12000rpm，离心3分钟，（无论是液体还是冻干粉状态），再打开管盖进行分装和保存（如果抗体体积小于50ul，请延长 离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）。抗体一般使用特制的储存管，只有在12000rpm离心3分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下 来（即使是在10000rpm离心也会离心不*，导致出现抗体的量不足的现象）。

      （2）对于ProSci大部分抗体，比较合适的保存方式是，分装后保存在-20℃或者-80℃。
       ①对绝大多数抗体来说，保存在-20℃就*足够了，没有任何证据显示保存在-80℃会更好。
       ②分装可以大的程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
       ③分装的量以一次实验用完为好，少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。
       ④复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来。
       ⑤抗体工作液应该当天配制当天用完，4℃保存尽量不要超过1天。
       ⑥一定避免将抗体保存在自动除霜冰箱中，将抗体保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。

       （3）大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性没有影响。

       （4）大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2周的时间，所以是在低温4℃的条件下来完成的。4℃运输主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中一定避免干冰运输。

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