ELISA试剂盒—加血清样本及反应试剂要点

    在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

    温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。 

    温育这一步是临床ELISA测定中容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口elisa试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较*的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点： 

    （1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原因为何?这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。

    （2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间*为*。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。 

    （3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

    总而言之，在实验ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。