诺氟沙星 ELISA 试剂盒制备方法及性能判定

诺氟沙星 ELISA 试剂盒研制与性能鉴定

诺氟沙星（norfloxacin, Nor）是第三代喹诺酮类药物，对革兰氏阳、阴性菌，一些支原体，衣原体，分枝杆菌属均具有活性[1-2]。由于杀菌效 果好，价格低廉，而广泛应用于动物饲料、饮水及动物疫病治疗中[3]。在动物体组织中形成残留并通过食 物链危害人体健康[4-5]。因此，必须建立快速、有效、 简便的诺氟沙星监测方法，严格监控诺氟沙星的使用， 以保证食品安全，维护消费者身体健康。【前人研究 进展】为了准确用药，降低超量使用对人及动物的危 害，科研工作者先后建立多种诺氟沙星检测方法。包 括液相色谱及衍生法[6-8]，简单色谱法[9]，毛细管电泳 及化学发光法[10-11]，新型光学探针法[12]，电化学传感 器法[13]，一阶导数同步荧光光谱法[14]，质谱结合量子 计算法[15]。上述方法检测结果比较，但需要比较 昂贵的检测仪器，而且对仪器操作人员有相应的技术 要求；样品制备要求比较复杂，测定步骤繁琐耗时， 检测一个样品需要耗费一天甚至更长的时间。酶联免 疫吸附实验是根据抗原抗体特异结合反应原理结合酶 标记技术建立的检测方法，检测步骤相对比较简单， 已有报道应用间接竞争 ELISA 法检测水体中诺氟沙 星残留[16]，但在该研究中使用的是多克隆抗体，而研 究认为多克隆抗体特异性不强，交叉反应比较多，难 以标准化。【本研究切入点】以单克隆抗体为基础的 ELISA 检测技术灵敏、特异，是药残、农残及毒素污 染监测技术的发展方向，但是目前还鲜见利用诺氟沙 星单克隆抗体建立 ELISA 检测试剂盒的报道。【拟解 决的关键问题】本研究以实验室所制备的诺氟沙星单 克隆抗体为基础，通过确定*抗体及二抗工作浓度， 研发诺氟沙星 ELISA 检测试剂盒，同时对试剂盒的各 种性能进行鉴定评价，为鲜奶中诺氟沙星残留检测提 供简便有效的技术手段。诺氟沙星是氟喹诺酮类药物的一种，其抗菌谱比 较宽且价格低廉，因此被广泛应用在畜牧行业中。而 其超量使用会在动物组织中残留，通过食物链危害人 类健康[21]，建立诺氟沙星免疫学快速检测技术对监控 诺氟沙星滥用，降低食品安全事件发生意义重大。

           诺氟沙星 ELISA 试剂盒的制备

ELISA 技术是目前应用zui为普遍的免疫分析方法，其具有灵敏性好，特异性强，便于操作等优点，因此得以在食品安全监控领域广泛应用[22]。本文所研 制的 Nor 试剂盒采用非均相间接竞争 ELISA 模式，将 包被原 Nor-OVA 包被在聚乙烯酶标板中，并利用蛋 白封闭液，封闭酶标板剩余的结合位点。进行样品检 测时，加入含诺氟沙星的样品或诺氟沙星标准品，同 时加入特定工作浓度的诺氟沙星单克隆抗体，这样形 成一个竞争体系，即酶标板上包被的 Nor 和加入到酶 标板中的游离 Nor，二者共同竞争结合加入的 Nor 单抗上有限的抗原结合位点，反应一定时间后，利用洗脱液把没有与酶标板上包被原结合的单抗及游离 Nor 清洗掉。加入辣根过氧化物酶标记的二抗与吸附在酶 标板上的 Nor 单抗结合，洗脱多余的酶标记二抗，然 后加入酶的显色底物，以此显示样品中 Nor 与单抗结 合情况。通过建立标准曲线，可以计算样品中 Nor 浓 度。本研究中利用自备的 Nor 单抗，采用方阵法确定 了单抗及酶标二抗工作浓度，从而建立了诺氟沙星间 接竞争 ELISA 试剂盒。

       诺氟沙星 ELISA 试剂盒的性能鉴定

ELISA 试剂盒性能是否良好，主要是通过以下几 个方面来鉴定，包括其灵敏性，检测限，特异性，准 确性，精密性，保质期等。同时还需要用目前的国标 方法来确证其性能[20]。本研究中制备的试剂盒检测限 为 1.00 μg·L-1，中国还没有规定奶中诺氟沙星残留zui 高*，而对同系物恩诺沙星*为 100 μg·L-1，达氟 沙星的*为 30 μg·L-1[23-24]，说明研制的诺氟沙星试 剂盒的检测*可以满足日常的检测要求。另外本研 究所制备的试剂盒和其他的氟喹诺酮同系物药物有一 定的交叉反应性，容易出现样品的假阳性结果。但是， 也正是由于这种交叉反应性，使得本研究制备试剂盒 既可以监控诺氟沙星残留，也可以监控其同系物药物 残留。本研究制备的试剂盒添加回收率比较高，变异系 数比较低；而且不同批次的试剂盒的添加回收率均比 较高，批内批间的变异系数均比较低。而一般认为， 试剂盒的样品添加回收率比较高，变异系数小于 15% 时就说明试剂盒的准确度及精密度比较高[20, 25]。

   中国的 GB/T 21312-2007 中明确规定，诺氟沙星 检测仲裁方法之一是 LC-MS/MS 法。用制备的诺氟沙 星 试剂盒 检测各 种浓度的 诺氟沙 星样品 时， 与 LC-MS/MS 进行检测结果一致，二者无显著差异，说 明本研究制备的试剂盒测定结果比较准确，性能可靠。 而用两者检测实际生产当中的未知样品时，二者结果 也*一致。当检测阴性样品时，二者均为未检出； 而检测阳性样品时，二者之间的检测结果差异不显著， 进一步说明所制备的试剂盒性能准确可靠。

                                   结论

本研究制备出灵敏、特异、准确，操作快速简 便的诺氟沙星间接竞争 ELISA 试剂盒。该试剂盒可 以同时监控氟喹诺酮类多个同系药物在奶中的残 留。试剂盒的开发有助于加强对该类兽药检测监控，为提高奶类产品安全，保护消费者身体健康提供技术支撑。