过氧化物酶的实验操作步骤解析

实验原理

　　血细胞中的过氧化物酶(Peroxidase,POX或MPO)能分解试剂中的底物H2O2，释出新生态氧，使无色联苯胺氧化为蓝色联苯胺，后者与亚硝基铁氰化钠结合形成蓝黑色的颗粒，沉着于细胞质中。

实验方法

　　材料：

　　1.1%TMB

　　2.亚硝基铁氰化钠饱和溶液

　　3.1%过氧化氢溶液

　　4.稀过氧化氢溶液

　　5.瑞氏染色液

　　6.新鲜涂片(骨髓或者血片)、染色架、显微镜等

　　方法：

　　1.取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10?l，溶液呈淡棕黄色。

　　2.在新鲜干燥的血片上，加混合溶液0.5ml，放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，染色6min。

　　3.自来水冲洗，待干，瑞氏染液复染15～20min。

　　4.自来水冲洗，待干，油镜镜检。

实验结果计算

　　细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。

　　（－）无颗粒沉着；

　　（±）颗粒细小，分布稀疏；

　　（+）颗粒较粗，局灶分布；

　　（++）颗粒粗大，分布较密，占胞质1/2~2/3；

　　（+++）颗粒粗大，呈团块分布，几乎布满胞质；

　　（++++）全部胞质均布满颗粒，可覆盖胞核。

注意事项

　　1.血涂片和骨髓片应该新鲜制作，涂片应该厚薄适宜；

　　2.TMB配置在85%~88%的乙醇溶液中效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差；

　　3.H2O2需新鲜配置，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见颗粒，红细胞呈棕色或者绿色，即表示H2O2过浓。若H2O2加于玻片上无气泡，则表示无效；

　　4.染色液pH为5.5；

　　5.试剂应置于低温暗处，防止应光线照射而失效。

过氧化物酶测定试剂盒产品优点如下：

1、快速简便：全程约2分钟，可测5例左右样本。

2、稳定性好：试剂盒2～8℃存放3个月有效。

3、再现性好：变异系数CV=1.4%。

4、回收试验： X =98%。

5、受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。