新手做ELISA实验：大家来围观解答

本期新闻中心应客户要求，让大家一起来围观解答新手做实验遇到的问题解答：

以下由客户自诉：

1.采用的是ELISA双抗体夹心法测定尿液标本中人肾损伤分子-1（Kim-1）水平。某一国产96孔ELISA试剂盒（本次实验只用了48孔，猜想应该不是试剂盒的原因，因为好几个师姐用的都是这家的试剂盒，结果还可以，能做出标准曲线，且复孔间差异并不大）。

2.一次加样时间：说明书上要求一次加样时间控制在5分钟内，而我的一次加样时间基本在10min以上。

实验前准备：

1.尿液样本的收集与保存：-80℃冰箱保存尿液标本1年左右，1周前在冰中融化分装，3000转离心30min取上清液（因离心管与离心机不匹配，故将尿液从原离心管吸至相匹配的离心管中，原离心管下边有尿沉渣，吸的时候未打匀而是直接吸的，不知道是否对结果有影响？），需要用的放在4度冰箱（做实验用的标本也就是放在4度冰箱约1周的标本），暂时不需要用的放在-20度冰箱。

2.试剂盒从4度冰箱取出，将需要用的试剂及板拿出来放在实验台平衡45min。

3.尿液实验前未做稀释处理。

操作步骤：

1.标准品的稀释与加样：按照说明书，我采用的垂直加样，只是加样速度慢，尽量加至底部，不触壁，不产生气泡。

2.温育说明书上要求30min，而我的大概是35min，是在培养箱中进行的。

3.洗涤：也是加样速度慢，全部加样后停了1min，甩干（甩到甩不出液体为止），然后在滤纸上拍干（拍到没有液体流出为止），就这样重复了5次。

4.显色：刚开始培养箱温度没升至37度，我也先放里边了，是等升至37度后开始计时的。

疑问：

1.为什么标准孔的浓度会出现如上图的结果？

2.为什么复孔间的差异这么这么的大？

实验中没有少加或加错样，恳请各位战友帮忙找原因，不胜感激！

1.为什么标准孔的浓度会出现如上图的结果？  你标准品也就120-80ng/L有些线性，可使后边的40-10ng/L OD值又再次突然高上去了，且40-10ng/L的OD值复孔间偏差还算不大。我觉得你先从稀释的角度看看吧，说明书提供的稀释方法太麻烦，可能会导致操作时出现问题，你不如在干净的EP管中按照标准品的比例关系进行稀释，稀释完后再统一加入酶标板孔中。

2.为什么复孔间的差异这么这么的大？ 我觉得两方面原因，你标准品复孔差异大，可能跟稀释手法有关。你的样本OD值3复孔间有时会出现偏差较大的情况 可能跟洗板有关系，用洗板机洗板洗，可能与你尿样未混匀也有关（虽然可能性很小）。但是我觉得和你说的：“故将尿液从原离心管吸至相匹配的离心管中，原离心管下边有尿沉渣，吸的时候未打匀而是直接吸的”没有什么关系，毕竟你已经离心取上清了。

至于加样时间5min还是10min，温预30min，还是35min等等操作上与说明书略有差异的地方都不是出现你这种结果的直接原因，毕竟双抗体夹心法的试剂盒对操作和时间没有竞争法那么严格。

说句实话我看到这个试剂盒的说明书时我*惊呆了，首先看标准曲线：

上图是劲马公司人TIM-1/KIM-1的ELISA说明书提供的数据,RND的线性范围有70倍左右，而你的试剂盒只有12倍，一般的双抗体夹心法线性范围都不会只有10倍左右；在看定量的试剂盒至少要有一个0点吧毕竟它代表了试剂盒包被抗体和酶标抗体的交叉反应情况（也就是试剂盒的背景），样本定值时至少要减去0点在定量吧，可使你的试剂盒只有一个空白孔（不加酶标试剂）只能算作显色液的背景。根本不能代表你试剂盒本身的背景情况。不知道你方不方便告知是什么牌子的试剂盒??zui后我想说一点：“猜想应该不是试剂盒的原因，因为好几个师姐用的都是这家的试剂盒，结果还可以，能做出标准曲线，且复孔间差异并不大”这并不能*排除试剂盒的问题，毕竟你师姐的项目是否和你一样？？就算一样批号一样吗？

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