ELISA实验常见问题及解决方法

ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。现将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
　　
　　下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法。
　　
　　一、选择试剂
　　
　　选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。
　　
　　二、加样
　　
　　可能原因：
　　
　　1）血清或血浆标本分离不好即进行加样；2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长（特别是室内温度较高时）；3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
　　
　　解决办法：
　　
　　1）标本为血清：将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟;标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟;若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。2）加样后及时放入孵箱。3）加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。4）如果采用AT或其他全自动加样，选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。5）标本较多时，请分批操作。
　　
　　三、孵育
　　
　　可能原因：
　　
　　1）孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗*;2）孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗*。
　　
　　解决办法：
　　
　　1）贴封片或加盖；2）按说明步骤严格控制操作时间。
　　
　　四、洗板
　　
　　可能原因：
　　
　　1）采用手工洗板，孔与孔之间液体交叉。2）采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不*；洗板针堵塞，抽吸不*;洗板不畅，导致洗板效果差。3）反应板过多造成洗板等待时间长。
　　
　　解决办法：
　　
　　1）保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；2）合理安排，或多用几台洗板机。
　　
　　五、显色
　　
　　可能原因：
　　
　　1）显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；2）加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
　　
　　解决办法：1）显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；2）加样时保持显色剂不外流；3）A、B液应避免接触金属器械。
　　
　　六、终止
　　
　　可能原因如加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。所以在加终止液时应避免产生气泡。
　　
　　七、读板
　　
　　如读板时板底不清洁等。应保证酶标板清洁。所以在整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸；尽可能实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。
　　
　　在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。