“上海劲马”_蛋白质相对分子质量的测定

 上海“劲马”蛋白质相对分子质量的测定

一、实验原理

蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。

聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。

二、仪器及器材

垂直电泳槽及附件、直流稳压稳流电泳仪、移液器等。

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三、试剂

1、凝胶贮备液：称取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），蒸馏水溶解后定容至100mL，滤纸过滤贮存。

2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。

3、10%过硫酸胺（AP），用时现配。

4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。

5、电极缓冲液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.3，加蒸馏水至1 000ml。

6、样品溶解（缓冲）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.0，再加0.1g溴酚蓝、2.5mL巯基乙醇，定容至100mL。

7、下层胶（分离胶）缓冲液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL调节pH至8.8，加蒸馏水至100ml。

8、上层胶（浓缩胶）缓冲液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL调节pH至6.8，加蒸馏水至100ml。

9、固定液：25%异丙醇，10%乙酸。

10、染色液：0.125g考马斯亮蓝R-250加固定液250ml。

11、脱色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。

12、1.5%琼脂：1.5g琼脂溶于100mL电极缓冲液中，加热溶解。

13、标准相对分子质量蛋白质。

四、操作步骤

1、电泳槽的安装

干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5%的琼脂密封。

2、样品的制备

称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mL去离子水研磨成匀浆，转入离心管中，再加入2mL去离子水冲洗研钵，3500r/min离心20min，上清液备用。

将标准蛋白质和待测样品分别溶于样品溶解液，在沸水中加热3-4min，待冷却后作点样用。

3、制胶

选择合适的胶浓度（表1），配制分离胶，混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖2-3mm水层，静止聚合约40min左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。

吸取分离胶的水分，将配好的浓缩胶（表1）注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。

表1 不同浓度凝胶体系

4、点样

用移液器分别吸取标准蛋白质5μL和样品液20μL，注入样品槽内的浓缩胶上面，同时在样品上小心地注入电极缓冲液。

5、电泳

加样完毕，电泳槽内注入适量电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80-100V，约3-4h后，指示剂达到距离前沿1-2cm时，可终止电泳。

6、固定

胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后将胶浸泡在25%异丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白质就会到固定。

7、染色

取出凝胶板，加入染色液染色2h。

8、脱色

将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止。

9、照相。

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